SINTESI E CARATTERIZZAZIONE
DI NUOVI POLIMERI ANFIFILICI COME “SURFACE MODIFIERS” DI NANOCARRIERS
Dott.ssa Valentina Pantò Dottorato di Ricerca in Tecnologia delle Sostanze Biologicamente Attive Start:01/01/2006 End: 31/12/2008 Università di Palermo Ministero dell’ Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica Unione Europea Università di Catania Tutor: Chiar. Prof. Rosario Pignatello
Coordin.: Chiar. Prof. Gaetano Giammona
SINTESI E CARATTERIZZAZIONE
DI NUOVI POLIMERI ANFIFILICI COME “SURFACE MODIFIERS” DI NANOCARRIERS
Dott.ssa Valentina Pantò Dottorato di Ricerca in Tecnologia delle Sostanze Biologicamente Attive Start:01/01/2006 End: 31/12/2008 Università di Palermo Ministero dell’ Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica Unione Europea Università di Catania Tutor: Chiar. Prof. Rosario Pignatello
Coordin.: Chiar. Prof. Gaetano Giammona
L= -CO-LAA ,-NH-LAA R= -CH2CH2OMe, -CH2CH2CO-LAA, CH2CH2NH-LAA n = 1-17; m = 0, 1, 2; R’= H; Boc; Fmoc R= OH; OCH3 Si tratta di derivati del PEG per coniugazione con uno o due residui di lipoamminoacidi m= 44,96
mPEGC2000/5000-LAA16 (n=13), m=44, o m=96
mPEGC2000/5000-LAA18 (n=15), m=44 o m=96
mPEGC2000/5000-LAA20 (n=17), m=44 o m=96 PEGBC2000-LAA16 (n=13), m=44
PEGBC2000-LAA18 (n=15), m=44
PEGBC2000-LAA20 (n=17), m=44 PEGDA2000-LAA16 (n=13), m=44
PEGDA2000-LAA18 (n=15), m=44
PEGDA2000-LAA20 (n=17), m=44 O n N H O O N n H O O O 3 H C m
mPEGN2000/5000-LAA16 (n=13), m=44 o m=96
mPEGN2000/5000-LAA18 (n=15), m=44 o m=96
mPEGN2000/5000-LAA20 (n=17), m=44 o m=96 O n N H n 3 H C n O N H 2 N H N H 2 O 3 H C m
O n N N H O H O O N n H O O N H O n O m
O
Opsonizzazione Processo attraverso il quale una particella o un organismo esterno viene ricoperto dalle opsonine, rendendola visibile ai fagociti bilayer farmaco opsonine MPS
(RES)
Indica la decorazione della superficie di una particella attraverso
catene di PEG adsorbite, intrappolate o innestate covalentemente PEG opsonine Lo scopo di queste catene di PEG
È creare una barriera per bloccare
l’adesione delle opsonine presenti nel siero, così che le particelle possono mimetizzarsi o rimanere invisibili ai fagociti
E’ il metodo preferito per impartire caratteristiche stealth o proprietà stericamente stabilizzate alle nanoparticelle. Questo termine indica la decorazione della superficie di una particella attraverso catene di PEG adsorbite, intrappolate o innestate covalentemente. Secondo questa teoria la natura flessibile e idrofilica delle catene di PEG sulla superficie gli permette di assumere una conformazione più estesa in soluzione. Quindi, quando le opsonine e altre proteine sono attratte a livello della superficie della particella, attraverso forze di van der Walls e altre forze, incontrano le catene di PEG estese alla superficie e iniziano a comprimerle. Questa compressione forza le catene di PEG in una conformazione più concentrata ed a più alta energia. Questa variazione di conformazione crea una forza repulsiva che si oppone che, quando è abbastanza grande, può completamente bilanciare e/o superare la forza attrattiva tra le opsonine e la superficie della particella. E’ importante notare che, lo strato di rivestimento della superficie deve superare uno spessore minimo per verificarsi il blocco effettivo o la repulsione delle opsonine,. L’esatto spessore dello strato può variare a seconda della situazione ed è spesso difficile da controllare. Quindi, lo spessore dello strato è generalmente correlato ad altri fattori come il peso molecolare del PEG, la densità della catena e la conformazione.
Gli iniziali obiettivi che sono stati perciò perseguiti sono i seguenti:
sintesi e la caratterizzazione chimica, fisico-chimica e strumentale di diverse serie di coniugati (tramite analisi MALDI-TOF mass spectrometry, FT-IR and 1H-NMR);
l’ottimizzazione dei relativi processi di sintesi (resa, purezza);
la valutazione dell’importanza del numero (1 o 2) e del tipo di LAA usato (lunghezza della catena alifatica laterale) sulle caratteristiche chimico-fisiche dei coniugati col PEG, come la solubilità in diversi solventi e, soprattutto, sull’affinità per i bilayer vescicole liposomiali. Quest’ultimo parametro è stato valutato mediante tecniche calorimetriche (DSC);
l’utilizzazione dei coniugati sintetizzati come surface modifiers di MLV a base di DPPC/Chol, caricati con una sonda fluorescente ed incubati in colture di cellule macrofagiche, al fine di valutare l’efficacia dei coniugati PEG-LAA nel ritardare o evitare l’uptake cellulare delle vescicole.
Per confermare i risultati della valutazione in vitro della loro capacità stealth, è stato fatto un confronto con classici liposomi multilamellari stealth modificati con DSPE-PEG, a base di DPPC/DPPS e dotati di carica superficiale netta negativa, testando la capacità di shielding della carica superficiale da parte di tali derivati, attraverso misure di potenziale zeta (confronto tra mPEGC2000-LAA e mPEGN2000-LAA con gli analoghi 5000);
una preliminare constatazione della possibilità di impiegare questi coniugati polimerici per la formazione di micelle polimeriche, sfruttando la loro bassa concentrazione micellare critica, da cui deriverebbe una buona stabilità nel plasma come vettori colloidali di farmaci lipofili.
Sintesi dei coniugati del bicarbossi-PEG con i LAA
Caratterizzazione dei coniugati PEG-LAA CH3OPEGC2000-LAA16 I derivati PEG-LAA sono stati caratterizzati poi mediante analisi FT-IR e 1HNMR e spettrometria di massa MALDI-TOF, che ne hanno confermato la struttura e l’ottenimento dei coniugati con un buon grado di resa e purezza.
I coniugati ottenuti presentano la peculiare prerogativa di possedere caratteristiche anfifiliche simili a quelle del doppio strato lipidico delle membrane cellulari (‘membrane-like character’) che possono facilitare la loro interazione o il loro passaggio attraverso le membrane stesse.
La coniugazione dei PeG con LAA oltre ad incrementare il carattere lipofilo dei primi ne ha incrementatao l’anfifilicità, proprietà fisico-chimica associata tra l’altro ai processi di interazione con membrane biologiche. Essendo i liposomi un valido modello di biomembrana,
Ogni campione è stato sottoposto a tre cicli di analisi (heating/cooling) ad
una velocità di scansione di 2°C/min. ed in un range di 15 a 60°C.
PARAMETRI TERMOTROPICI UTILIZZATI SONO:
Variazione della temperatura di transizione di fase (ΔT%): [Tm−T°m/T°m]·100
Variazione di entalpia associata a tale transizione [Δ(ΔH)%]:
[ΔH − ΔH°/ ΔH°] ·100
Variazione della forma del picco endotermico di transizione
di fase
Tm: praticamente invariato
ΔH: piccole riduzioni e inversamente proporzionali alla concentrazione molare del mPEG-COOH nei bilayer liposomiali
Effetto limitato solo sugli strati fosfolipidici superficiali
Riduzione del valore di ΔH proporzionale alla concentrazione.
Aumento del valore di t1/2. Segregazione di fase al 10% in moli. Interazione più profonda
con le catene
aciliche Curve DSC di MLV di DPPC in presenza di percentuali molari crescenti
di mPEG-stearato
Curve DSC di MLV di DPPC in presenza di percentuali molari crescenti
di mPEGC-LAA16 Interazione sia a livello delle teste polari che a livello delle catene aciliche dei fosfolipidi e una maggiore penetrazione nei bilayer più profondi 2000 5000 Riduzione di Tm e di ΔH lineare con le sue concentrazioni nelle vescicole liposomiali.
Aumento di t1/2 e dell’intervallo di transizione della DPPC (a concentrazioni ≥5%).
Curve DSC di MLV di DPPC in presenza di percentuali molari crescenti
di mPEGC-LAA18 Effetto di slargamento del picco endotermico Perdita progressiva della “cooperatività” del sistema liposomiale Segregazione di fase al 10%in moli 2000 5000
Curve DSC di MLV di DPPC in presenza di percentuali molari crescenti
di mPEGC-LAA20 Maggiore disturbo sull’impaccamento ordinato dei bilayer e abbassamento della cooperatività delle vescicole liposomiali 2000 5000 Riduzione del valore di ΔH, diminuizione graduale di Tm Minore disturbo sull’impaccamento ordinato dei bilayer ed aumento della cooperatività delle vescicole liposomiali Aumento contemporaneo del valore di ΔH, di t1/2 e del range di transizione di fase
In linea generale si può desumere per quanto concerne i derivati mPEGC-LAA che la mx conc molare da proporre per il loro impiego come surface modifiers di drug systems colloidali è del 5% mol
variazioni non significative di Tm e ΔH, se non al 10%. Evidenti riduzioni di Tm e ΔH, lineari con la sua concentrazione molare
PEGDS:ciò giustifica una interaz maggiore del PEGDS ed una sua penetrazione più profonda nei bilayers interni di DPPC rispetto al suo omologo inferiore dipropionato, probabilmente riconducibili al suo maggiore carattere lipofilo attribuitogli dal residuo di acido grasso a lunga catena ed al suo minor punto di fusione…
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