Mappaggio di geni malattia mediante analisi di linkage: l’esempio della Paraparesi Spastica EreditariaDipartimento di Biologia Universita’ degli Studi di Padova
Mappaggio di geni malattia mediante analisi di linkage: l’esempio della Paraparesi Spastica Ereditaria
Dipartimento di Biologia Universita’ degli Studi di Padova
Analisi di linkage PARAMETRICA NON PARAMETRICA - No modello genetico - Caratteri complessi ASP: Affected Sib Pairs
APM: Affected Pedigree Member - Preciso modello genetico
modalità di eredità
frequenze geniche
penetranza di ciscun genotipo
- Caratteri mendeliani Calcolo dei lod score
(Morton 1955)
Lod score - A 2 punti: probabilità di linkage tra 2 loci (MLINK) probabilità che i due loci siano associati 0<<0.5
probabilità che i due loci non siano associati = 0.5 Lod score Z= log10
Valori soglia Z> +3 accettare il linkage Z< -2 escludere il linkage - A più punti: localizzazione del gene malattia rispetto ad una batteria di marcatori (LINKMAP, GENEHUNTER)
Paraparesi Spastica Ereditaria (HSP)
Malattia neurodegenerativa
Esordio variabile (II- IV decade di vita)
Progressiva spasticita' degli arti inferiori
Aumento dei riflessi tendinei
Patogenesi: degenerazione assonale tratti corticospinali e colonna dorsale ETEROGENEITA’ clinica genetica Forme non complicate Forme complicate Spastina Paraplegina AD-HSP
AR-HSP
X-linked HSP SPG 3
SPG 4
SPG 6
SPG 8
SPG 9
SPG 10
SPG 12
SPG 13
SPG 5
SPG 7
SPG 11
SPG 14
SPG 1
SPG 2
SPG15 L1CAM PLP
Paraplegina
(Casari 1998) Spastina
(Hazan 1999) SPG7 AR-HSP
(De Michele 1998)
mitocondrio
ATPasi
AAA,
peptidasi M41
SPG4 AD-HSP
(Hazan 1994)
nucleo
ATPasi
AAA (ATPases Associated with various cellular Activities)
Locus
localizzazione
funzione biochimica
domini caratteristici
CARATTERISTICHE CLINICHE: Diagnosi: Paraparesi Spastica Ereditaria
Esordio: 30 anni
Altre caratteristiche: - piede cavo bilaterale
- neuropatia motoria distale evidenziata da MCV nervo SPE
- disturbi cognitivi 5 11 10 9 8 7 6 4 3 2 1 12 IV III V 1 2 3 4 1 2 1 2 I II 3 3 2 2 2 2 2 3 2 Famiglia con HSP complicata
Simulazione di linkage 1 1 0 0 1 1 2 3
1 2 0 0 2 2 1 4
1 3 1 2 1 2 3 4
1 4 1 2 2 1 2 4 1 2 3 4 1. Pedigree file 2. Parameter file Calcolo del lod score potenziale mediante i programmi SLINK e MSIM
Modello di eredità: autosomica recessiva
Frequenza dell’allele malattia: 1:10.000
Penetranza: 100%
Alleli del marcatore simulato: 5 alleli equifrequenti Max lod score potenziale Zmax = 2.82 a = 0.0
Metodo: Genomewide Search - 400 microsatelliti (CA repeats) distribuiti in 28 pannelli
- Range di lunghezza: 69-395 basi
- Elevata informatività (eterozigosità media: 0.8)
- Distribuiti lungo il genoma con una distanza media di 10 cM
- Marcati con molecole fluorescenti: FAM blu , HEX verde, NED giallo ABI PRISM Linkage Mapping set version 2 (PE Applied Biosystems) Caratteristiche dei marcatori
Metodica utilizzata Amplificazione in piastre da 96 pozzetti Pool di marcatori per un individuo Elettroforesi su sequenziatore ABI 373 Collection file Results file Lettura alleli Lod score Genescan Collection Genescan analysis 3.0 Geotyper 1.1.1 MLINK
Genescan Analysis 3.0 file Genotyper 1.1.1 file
Linkage Reporter % di Esclusione del genoma % di esclusione per ogni cromosoma
Regioni di positività Cromosoma 1 Cromosoma 3 Cromosoma 9
Report del cromosoma 3
Analisi della regione candidata 3q27-q28
selezione di ulteriori 15 marcatori microsatelliti localizzati nella regione di interesse dalla mappa di UDB: Unified DataBase for Human Genome Mapping
http://bioinformatics.weizmann.ac.il/udb/
MULTIPOINT
(Genehunter 1.3) Zmax = 3.9 per D3S1601
Z > 3.00 tra D3S1580 e D3S3669 Lod score
Analisi di linkage Regione cromosomica candidata Gene malattia (mutazioni patogene) Clonaggio posizionale Costruzione di mappe genetiche e fisiche ad alta risoluzione Costruzione di contigui di cloni Identificazione e sequenziamento dei trascritti Ricerca di mutazioni patogene in pazienti Mappaggio EST
sequenziamento e ricerca di ORF
screening di librerie di cDNA
“exon trapping”
ricerca di isole CpG ipometilate
Limiti del clonaggio posizionale Dimensioni della regione
N° di geni presenti 95 96 97 98 99 Progetto Genoma Umano Mb Sviluppo di databases
Clonaggio posizionale-candidato
(candidate positional cloning) Espressione
Funzione
omologia con altri geni umani
omologia con geni in organismi
modello (Topo, Drosophila...) Analisi della regione candidata mediante consultazione di DATABASE Individuazione dei geni noti Selezione dei geni candidati Ricerca di mutazioni patogene in pazienti
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