Valutazione dell’efficacia di sistemi nanoparticellari a matrice lipidica nella veicolazione di attivi farmaceutici e cosmetici Dottorato di Ricerca in:
Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive XIX ciclo - CHIM 09
Coordinatore: Tutor:
Ch.mo Prof Gaetano Giammona Ch.mo Prof Francesco P. Bonina Ministero dell’Università e della
Ricerca Scientifica e Tecnologica Università degli Studi di Palermo Luisa Rizza
Valutazione dell’efficacia di sistemi nanoparticellari a matrice lipidica nella veicolazione di attivi farmaceutici e cosmetici Dottorato di Ricerca in:
Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive XIX ciclo - CHIM 09
Coordinatore: Tutor:
Ch.mo Prof Gaetano Giammona Ch.mo Prof Francesco P. Bonina Ministero dell’Università e della
Ricerca Scientifica e Tecnologica Università degli Studi di Palermo Luisa Rizza
Il dottorato svolto ha avuto come argomento di ricerca la valutazione ….
Principali sistemi nanoparticellari
Liposomi
Nanoparticelle polimeriche
Nanoparticelle a matrice lipidica
I sistemi nanoparticellari a matrice lipidica, insieme ai liposomi,alle nanoparticelle polimeriche ai cubosomi, fanno parte di quei sistemi sviluppati in questi ultimi anni, utilizzati come carrier per la veicolazioni di sostanze attive. E’ noto infatti che molte sostanze, pur possedendo una buona attività biologica, presentano proprietà biofarmaceutiche e farmacocinetiche poco favorevoli e tali da non garantire l’effetto terapeutico desiderato.L’impiego di sistemi carriers ha dimostrato di in molti casi migliorare la biopdisponibilità di tali sostanze attive, senza modificarne la struttura chimica, rendendo possibile il loro impiego anche in nuovi campi applicativi o in nuove vie di somministrazione non possibili quando veicolati mediante formulazioni di tipo convenzionale.
elevata biocompatibilità
possibilità di mettere in atto strategie di “drug targeting”
uso di tensioattivi ben tollerati quali poloxameri, lecitina e tweens
elevata capacità di caricamento di farmaci lipofili
assenza di problemi nella produzione su larga scala e nel processo di sterilizzazione Sistemi nanoparticellari a matrice lipidica Introdotti alla fine degli anni novanta dalla combinazione dei vantaggi delle particelle solide, dei liposomi e delle nanoemulsioni, tali carrier presentano importanti vantaggi:
Nati alla fine degli anni novanta dalla combinazione delle caratteristiche delle particelle solide, dei liposomi e delle nanoemulsioni, le nanoparticelle lipidiche hanno mostrato di possedere importanti vantaggi quali:
Sistemi nanoparticellari a matrice lipidica Solid Lipid Nanoparticles
“SLN” Nanostructured Lipid Carriers
“NLC” Pregi
Ridotte dimensioni (50~1000 nm)
Elevata adesione allo
strato corneo
Effetto occlusivo Limiti
“burst effect”
limitata capacità di carico Pregi
possibilità di “controlled release”
maggiore stabilità nel tempo
maggiore capacità di carico (drug loading)
riduzione dei fenomeni di espulsione della sostanza attiva durante lo stoccaggio
Si distinguono attualmente due tipi di sistemi nanoparticellari a matrice lipidica: le SLN e le NLC. I primi sistemi utilizzati con successo furono le SLN che presentano diversi vantaggi quali…… A tali vantaggi si associano però alcuni limiti come…., recentemente superati dalla introduzione delle NLC, caratterizzate da una matrice lipidica costituita dalla miscela di lipidi solidi e lipidi di natura oleosa che garantiscono una struttura meno ordinata e quindi una > capacità di carico della sostanza attiva e soprattutto una riduzione dei fenomeni di espulsione di questa dalla matrice lipidica nel tempo
promuovere o aumentare la penetrazione
a differenti livelli della pelle consentendo
un targeting cutaneo mirato
superare l'incompatibilità tra ingredienti
di natura diversa
prevenire l'ossidazione e/o la decomposizione
di sostanze particolarmente sensibili
creare dei serbatoi tissutali per un rilascio prolungato e/o controllato nel tempo
aderire sullo strato corneo e provocare un effetto occlusivo con conseguente
aumento della capacità permeante dell’attivo Applicazione topica Sistemi nanoparticellari a matrice lipidica
In una prima fase le nanoparticelle solide lipidiche sono state studiate per vie di somministrazione non-dermica mostrando una buona capacità di superamento delle barriere biologiche cellulari, anche a livello di aree inusuali come nel caso della barriera emato-encefalica (BEE), dei tessuti oculari e della mucosa intestinale. Negli ultimi anni, le nanoparticelle lipidiche sono state utilizzate come carrier in formulazioni topiche e non solo per prodotti farmaceutici ma anche in campo cosmetologico, con importanti vantaggi applicativi quali:
Caratteristiche comuni
~ difficoltà di somministrazione orale per
trattamento patologie cutanee
~ medio-basso valore di emivita
~ elevata lipofilia Progetto di ricerca 1. Valutazione delle NLC nella veicolazione di NSAIDs Ketoprofene - Preparazione
- Caratterizzazione (PCS)
Studio di permeazione in vitro
ed in vivo
Naprossene - Preparazione
- Caratterizzazione (PCS)
Studio di permeazione in vitro
ed in vivo
Indometacina - Preparazione
- Caratterizzazione (PCS, DSC)
- Studio di permeazione in vitro
- Studio di permeazione in vivo Ketorolac (attività analgesica) - Preparazione
- Caratterizzazione (PCS)
Studio di permeazione in vitro
- Confronto con derivati pro-drugs
Il lavoro svolto durante il dottorato di ricerca ha riguardato in una prima fase la valutazione dell’efficacia delle NLC nella veicolazione di sostanze farmaceutiche ed in particolare di farmaci antinfiammatori non steroidei (NSAIDs), ampiamente utilizzati nel trattamento di affezioni a carico della cute e del tessuto muscolo scheletrico La scelta delle NLC è stata dettata dal fatto che la maggior parte dei lavori scientifici ha riportato per le SLN un profilo di rilascio di tipo BURST, immediato e massivo. Le NLC, pur presentando una struttura a tratti riconducibile a quelle delle SLN sono ritenute più idonee a garantire l’ effetto desiderato di prolonged release. In una prima fase studi di preparazione, caratterizzazione, di permeazione in vitro ed in vivo sono satti effettuati utilizzando una molecola modello come l’indometacina. Successivamente l’attenzione è stata rivolta ad altri due FANS: naprossene, ketoprofene e ketorolac, per quest’ultimo farmaco ad azione prevalentemente analgesica sono satte poste a confronto due disverse strategie: l’impiego di prodrugs e di carriers NLC. Pur nella loro diversità chimica, tali farmaci presentano esigenze comuni quando applicati sulla pelle:
Progetto di ricerca 2. Valutazione SLN nell’applicazione di attivi cosmetici Novel Cosmetic Delivery Systems (NCDS) octil-metossicinnamato (OMC) Effetto dei parametri delle preparazione sulle dimensione delle SLN mediante analisi fattoriale Iniezione del solvente Omegeneizzazione ad alta
pressione a caldo (HPH) Effetto delle SLN sulla stabilità e sulla sicurezza d’impiego dell’OMC Studi di permeazione cutanea in vitro Studi di permeazione cutanea in vivo Studi sull’effetto protettivo sui fenomeni
di fotoinstabilità del filtro solare
In un secondo momento, l’interesse dello studio condotto è stato rivolto all’impiego di tali sistemi nanoparticellari come Novel Cosmetic delivery Systems nella formulazione di quelli che sono correntemente definiti come cosmeceutici, cioè entità ibride poste tra i prodotto farmaceutico e quello cosmetico. Vista la natura innovativa dello studio, la scelta formulativa è ricaduta sull’impiego delle SLN per la loro semplicità strutturale e di un ingrediente cosmetico di ampio utilizzo e di notevole interesse per la sua natura funzionale come il filtro solare OMC. Il protocollo ha quindi previsto, in una prima fase, uno studio tecnologico sull’aspetto produttivo mettendo a confronto due metodiche di preparazione delle SLN, in particolare l’omogeneizzazione ad alta pressione a caldo (HPH) e l’iniezione del solvente mediante l’impiego di metodi di analisi fattoriale e successivamente la valutazione delle capacità protettive delle SLN nei confronti dei fenomeni fotodegradativi a cui l’OMC è normalmente soggetto e quindi e della sicurezza d’impiego ed efficacia mediante studi di permeazione in vitro ed in vivo.
1. Valutazione delle NLC
nella veicolazione di NSAIDs Protocollo sperimentale
- Preparazione
- Caratterizzazione
- Studio di assorbimento percutaneo
Nella valutazione delle NLC nella veicolazione di farmaci antinfiammatori non steroidei, il protocollo sperimentale ha previsto la preparazione la caratterizzazione e la valutazione dei fenomeni permeazione cutanea del farmaco dalla formulazione
Compritol 888 ATO (12 g) 85 °C Soluzione acquosa di Pluronic F 68(1.3% p/v) 85 °C 85 °C Emulsionamento (8000 rpm) + ultrasonicazione Raffreddamento rapido + Miglyol 812 (4,71 ml)
(240 mg) 85 °C
Preparazione
Le nanoparticelle sono state prodotte mediante il metodo della fusione combinato all’uso degli ultrasuoni. La fase lipidica, addizionata del farmaco e condotta ad una temperatura di 85°C, viene aggiunta alla soluzione acquosa di tensioattivo alla stessa temperatura. La pre.emulsione così prodotta è sottoposta all’azione di un sistema ad agitazione meccanica ad alta velocità (ultraturrax) e quindi all’azione di un sistema ad ultrasuoni. Il rapido raffreddamento del sistema con bagno di ghiaccio determina la formazione delle NLC.
Caratterizzazione Analisi dimensionale: Spettroscopia di fotocorrelazione (PCS)
Analisi termocalorimetrica: Calorimetria a scansione differenziata (DSC)
Determinazione del contenuto di farmaco
Quantità di farmaco presente nelle particelle lipidiche
Quantità di particelle lipidiche recuperate DRUG CONTENT (%) =
Quantità di farmaco presente nelle particelle lipidiche
Quantità di farmaco aggiunta inizialmente al sistema DRUG RECOVERY (%) =
Le dimensioni medie particellari sono state determinate mediante spettroscopia di fotocorrelazione e, per il farmaco modello indometacina, è stat condotta una analisi termocalorimetrica mediante DSC. Infine la determinazione del contenuto in farmaco è stato espresso sia come drug content che come drug recovery.
Studi di assorbimento percutaneo
in vitro Membrane SCE Protocollo
membrane provenienti da
6 diversi soggetti (n=6)
quantità applicata di ciascuna
formulazione (89% w/w
sospensione NLC): 300 mg
prelievi nel corso delle 24-36
ore: 200 l
membrana SCE
camicia riscaldante ingresso acqua uscita acqua braccio laterale
per il prelievo
della soluzione
receptor magnete donor
Gli studi di assorbimento percutaneo in vitro sono stati condotti impiegando membrane SCE strato corneo epidermide umane montate su celle statiche di diffusione di Franz e valutando i flussi di rilascio del farmaco dalle formulazioni applicate.
Studi di assorbimento percutaneo
in vivo Tape-stripping Protocollo
dieci volontari sani (25–35 anni)
pretrattamento con 200 mg di
ciascuna formulazione (89% w/w
sospensione NLC)
tempo di applicazione: 6 ore
rimozione del corneo (20 tapes)
dopo1h, 3h e 6h dalla rimozione
delle formulazioni
- estrazione farmaco da tapes
Gli studi di assorbimento percutaneo in vivo hanno previsto l’impiego sia del modello del tape.stripping che del modello dell’eritema indotto da radiazioni UVB.
Strippings Avambraccio Pretrattamento Avambraccio 1 ora 3 ore 6 ore Formulazione 1h 1h 1h 3h 3h 3h 6h 6h 6h Tape-stripping
Per il tape stripping il protocollo sperimentale ha previsto l’applicazione della formulazione sui siti cutanei precedentemente demarcati sulla superficie ventrale degli avambracci di ciascun soggetto e la successiva rimozione dello strato corneo ad 1 h a 3 e a 6 ore dalla rimozione della formulazione mediante cerotto adesivo .La quantità di farmaco contenuta dalla strato corneo per ciascun sito è stata determinata mediante analisi HPLC.
Studi di assorbimento percutaneo
in vivo Modello dell’eritema indotto da radiazioni UVB Protocollo
- sei volontari sani (25 – 35 anni)
pretrattamento con 100 mg di ciascuna formulazione (89%
w/w sospensione NLC)
- tempo di applicazione: 6 ore
- tempi di esposizione: 2 X MED (min. dose eritematogena)
- esposizione sui siti di applicazione dopo 1h, 3h e 6h dalla
rimozione della formulazione
monitoraggio dell’eritema indotto per 52 ore con
spettrofotometria di riflettanza
Lo stesso protocollo sperimentale è stato adottato per il modello dell’eritema indotto da radiazioni UVB
Eritema indotto Avambraccio Pretrattamento Avambraccio Studi di assorbimento percutaneo in vivo UVB 1 ora UVB 3 ore UVB 6 ore Controllo Formulazione Controllo 1h 1h 1h 3h 3h 3h 6h 6h 6h
Anche in questo caso i siti pretrattati con ciascuna formulazione campione sono stati esposti ad una lampada ultravioletta per un tempo pari al doppio della minima dose eritematogena di ciascun soggetto a tempi diversi, cioè ad 1 , 3, 6 ore dalla rimozione della formulazione. Il monitoraggio dell’eritema è stato condotto mediante una tecnica non invasiva come la spettrofotometria di riflettanza. Lo strumento fornisce dei dati spettrali dai quali è possibile calcolare la percentuale di inibizione dell’eritema, parametro espressione della capacità della formulazione campione di inibire l’eritema indotto dalle radiazioni UVB su ciascun sito cutaneo
Percentuale di inibizione
dell’eritema (P.I.E.) dove:
AUC(T) : area sotto la curva I.E./tempo dei siti trattati
AUC(C) : area sotto la curva I.E./tempo dei siti di controllo
Lo strumento fornisce dei dati spettrali dai quali è possibile calcolare la percentuale di inibizione dell’eritema, parametro che è espressione della capacità della formulazione campione di inibire l’eritema indotto dalle radiazioni UVB su ciascun sito cutaneo
Valutazione dell’assorbimento percutaneo di indometacina M.Ricci, C.Puglia, F. Bonina, C.Di Giovanni, S.Giovagnoli and C.Rossi. Evaluation of indomethacin percutaneous absorption from nanostructured lipid carriers (NLC):in vitro and in vivo studies J.Pharm.Sci, 2005, 94(5), 1149-59
F. Castelli, C. Puglia, M.G. Sarpietro, L. Rizza and F. Bonina. Characterization
of indomethacin loaded lipid nanoparticles by differential scanning calorimetry
Int.J.Pharm. 2005, 304 (1-2), 231-8
I primi studi hanno riguardato la valutazione dell’assorbimento percutaneo del FANS indometacina
Caratterizzazione Dimensioni medie
NLC-Indometacina: 198.1 ± 9.05 nm
NLC vuote: 184.3 ± 5.2 nm Formulazione Drug
Recovery (%) Drug
Content
(%) NLC-Indometacina 98.4 1.34
Le particelle prodotte hanno mostrato valori dimensionali nanometrici dell’ordine dei 200 nm quando caricate con tale farmaco e una buona capacità di caricamento, come è possibile osservare dai valori di drug recovery e drug content Tali risultati sono sicuramente riconducibili alla elevata affinità e solubilità del farmaco verso il lipide oleoso utilizzato nella preparazione delle NLC
Analisi calorimetrica (DSC) NLC
Le NLC vuote (curva a) presentano un picco a 67°C e un plateau a 71°C.
La presenza dell’indometacina (curva c) comporta:
una definita struttura a due picchi invece del plateau sopracitato Caratterizzazione
L’analisi calorimetrica in DSC ha permesso di ottenere importanti informazioni relative all’interazione tra il farmaco e la matrice lipidica impiegata. L’inclusione del farmaco nel sistema lipidico determina una trasformazione del plateau presente a 71 C nel caso delle NLC vuote o di quelle in cui il farmaco è stato semplicemente disperso meccanicamente nella sospensione in un picco ben definito. Tale variazione del picco calorimetrico è indicativo della preferenziale dissoluzione del farmaco nella fase oleosa presente in nanocompartimenti dispersi nella matrice solida lipidica. Il rilascio del farmaco sarà quindi influenzato dai fenomeni di ripartizione tra tali nanocompartimenti oleosi, la matrice solida e la fase acquosa circostante e maggiore sarà l’affinità del farmaco per la matrice lipidica maggiore sarà la garanzia di ottenimento di un profilo di rilascio controllato alla pelle.
NLC cariche
NLC vuote +
farmaco libero
▲gel controllo Studi di assorbimento percutaneo
in vitro
Profili di permeazione cutanea attraverso SCE di indometacina
Dai dati raccolti dagli studi di assorbimento percutaneo in vitro è stato possibile costruire le curve che rappresentano la quantità cumulativa di indometacina permeata attraverso la membrana SCE in funzione del tempo e dalla quali è stato possibile estrapolare il flusso allo stato stazionario per ciascuna formulazione campione
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