Sequenze consenso
AAUAAA è riconosciuta da cleavage and polyadenylation specific factor (CPSF)
La regione GU-rich da Cleavage stimulation factor F (CstF)
Produzione del 3’ terminale di mRNA eucariotici
La sequenza AUAAA è riconosciuta da CPSF, la GU-rich da CstF, poi reclutano altri fattori che tagliano il DNA e viene reclutata poli-A-polimerasi (PAP)
Lo splicing
RNA Processing
Esoni introni: esempi di due geni umani
Esempi di splicing alternativo
Sequenze consenso per gli introni
Consensus sequence
Un’alte conservazione si trova solo immediatamente all’interno degli introni alle giunzioni presunte. Questo identifica la sequenze di un introne generico come la regola : GU##AG: o GT-AG.
I due siti hanno sequenze diverse e definiscono le terminazione degli introni direzionalmente .
Che meccanismo fa in modo che i due siti sono tagliati insieme?
Tutti i site 5¢ e 3¢ sites sono funzionalmente equivalenti, ma lo splicing segue delle regole che assicurano che il sito 5¢ è sempre collegato al sito 3¢ che viene dopo nel RNA.
Il meccanismo dello splicing
Attacco del 2’OH al 5’ splicing site con formazione del cappio
Attacco del 3’OH libero al 3’ splicing site
Liberazione del cappio
Meccanismo dello splicing
La giunzione a tre vie del cappio
Il branch site nei lieviti è conservato ed la sequenza consenso è UACUAAC..
Il branch site si trova 18-40 nucleotidi a monte del 3 ¢ splice site.
gli eucarioti superiori hanno sequenze correlate (cryptic sites)
Il ruolo del the branch site è di identificare il 3’ più vicino come bersaglio per collegarlo al 5 ¢ splice site
transesterificazione
Il primo passaggio è un attacco nucleofilo dal 2 ¢ –OH della A invariante del UACUAAC
Nel secondo passaggio, il 3¢ –OH libero dell’esone attacca il legame al 3¢ splice site.
caratteristiche
Gli Splice sites sono generici: non hanno specificità per gli RNA individuali,
L’apparato dello splicing non è tessuto specifico;
Lo splicing avviene solo tra siti 5’ e 3’ dello stesso introne.
Lo splicing segue un cammino preferito.
la reazione non procede sequenzialmente lungo il precursore.
spliceosoma
Le snRNPs coinvolte nello splicing sono U1, U2, U5, U4 e U6. Ogni snRNP contiene un solo snRNA e alcune (<20) proteine. Un nucleo strutturale comune per ogni snRNP consiste in un gruppo di 8 proteine, tutte riconosciute da un antisiero autoimmune chiamato anti-Sm Il complesso si assembla sequenzialmente sul pre-mRNA, e lo splicing avviene solo dopo che tutti i componenti si sono assemblati
Il nucleo e il citoplasma contengono molti piccoli RNA (200-300 bp)
Quelli nel nucleo sono chiamati small nuclear RNAs (snRNA); e quelli nel citoplasma small cytoplasmic RNAs (scRNA).
lo spliceosome include un 50-60S ribonucleoprotein particle (più grande di quella del ribosoma), con 150 proteine
Gli snRNAs sono necessari per lo splicing
I cinque snRNPs coinvolti nello splicing sono U1, U2, U5, U4, e U6.
Insieme ad altre proteine addizionali, gli snRNPs formano lo spliceosome. Tra esse: U2AF (U2 Auxillary Factors) e BBP (branch point Binding Proteins).
Le proteine agiscono in modo coordinato con la formazione di tre complessi intermedi
Splicing steps
U1 snRNP inizia lo splicing legandosi allo 5¢ splice mediante una reazione di appaiamento RNA-RNA.
Si forma il complesso E (early) che contiene U1 snRNP legato allo 5¢ splice site, la proteina U2AF legata al tratto di pirimidine tra il branch site e allo 3¢ splice site, e le SR proteine che collegano U1 snRNP a U2AF.
(Le SR si legano ai siti di splicing degli esoni: ESE =exonic splicing enhancer)
complesso E: early presplicing
contiene U1 snRNP legato al 5’splice-site
U2AF legata a Py tract ed al 3’ splice-site
Questa recluta BBPche si lega al branch site.
Quindi tutti i siti sono riconosciuti
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