XTP+(XMP)n(XMP)n+1 +2 Pi
DG= -7 kcal/mol Keq circa 105 Un attacco nucleofilo del 3’OH al a-fosfato con meccanismo Sn2 Reagenti: i 4 desossinucleotidi trifosfati dNTP
template e primer con 3’OH libero
Meccanismo della DNA Pol
Le coppie di basi devono aver ingombro sterico identico: AT o GC. Questo permette che 3’OH e a-fosfato siano in posizione ottimale
Gli rNTP non sono accettati per selezione sterica
DNA polimerasi
DNA pol ha la forma di una mano: palmo, dita e pollice
Il palmo è beta sheet
Ha il sito catalitico e contiene ioni bivalenti
Controlla l’accuratezza dell’appaiamento
Le dita. Hanno alfa eliche
Trattengono dNTP
Piegano il templato di 90°
Pollice
Interagisce con DNA neosintetizzato, mantiene la posizione corretta del primer e stabilizza il contatto DNA -Pol
I metalli
Mg o Zn
attivano il 3’OH
Stabilizzano il pirofosfato
Movimento dell’elica O delle dita
Il cambiamento di conformazione aiuta anche il movimento del DNA
processività
N. di nucleotidi polimerizzati sequenzialmente (fino a 1000/sec)
La prima fase di legame al DNA è lenta (1 sec), quelle successiva molto veloci
La processività è dovuta alla capacità di rimanere legata al templato
È aumentata dalla interazione con la sliding clamp
Proofreading
Tutte le polimerasi batteriche hanno attività 3’5’ esonucleasica (proofreading), riduce l’errore da 10-5 a 10-7
Solo la replicazione del DNA 5’3’ permette un’efficiente correzione degli errori
DNA pol. caratteristiche
La sintesi è sempre 5’3’
Fidelity: errori causati da incorporazioni errate causano sostituzioni. Determinato dall’attività di proofreading
Processivity: tendenza a rimanere sul template. Controlla frameshifts e replication slippage
Per evitare errori si può:
Controllare che la base entrante sia complementare al templato (presynthetic errors)
Controllare la base dopo che è stato incorporata: proofreading
La forca di replicazione
Ha una struttura asimmetrica:
leading strand sintetizzato con continuità
Lagging strand sintetizzato con discontinuità
Inizio
L’inizio (priming) Necessita di un primer con 3’ Libero
Questo può esser ottenuto in vari modi:
RNA primer
Un Nick libera DNA primer
Una proteina
Uno speciale enzima che polimerizza i nucleotidi sintetizza i corti RNA primers sul lagging strand
Il leading strand necessita solo di un primer per iniziare.
Il lagging strand ha bisogno di tanti primers per fare gli Okasaki fragments
Sono fatti dalla DNA primase RNA di 10 nt ogni 100-200 nt di DNA
In Coli: primase (dnaG), 60 kD.
rimozione dei primers
Gli RNA sono poi eliminati per azione della RNAsi H, DNA pol I e ligasi
Le elicasi aprono la doppia elica
Usano ATP
Sono esameriche ed hanno processività
Hanno una polarità 3’5’ o viceversa
Elicasi
Test dell’attività elicasi L’attività elicasica consiste nella denaturazione del DNA
Single-strand binding protein (SSBP)
Le SSBP hanno legame cooperativo
Danno la DNA una conformazione distesa
La DNA topoisomerase impedisce l’aggrovigliamento durante la replicazione
Elicasi e topoisomerasi cambiano la conformazione del DNA per facilitare l’attività della DNA pol.
DNA polimerasi
Esistono molte DNA polimerasi..
In E. coli:
DNA Polimerasi I: per riparazione del DNA danneggiato
DNA Polimerasi II: anche per riparazione del DNA
DNA Polimerasi III: è fatta da molte subunità. È la replicasi.
DNA Polimerasi I
Di gran lunga la più abbondate in E. coli
Un peptide di 103 kDa
Per digestione dà
il Klenow fragment (68 kD) che contiene al C-terminale la attività polimerasi, al N-terminale la proofreding
Il frammenti piccolo (35 kD) con attività esonucleasica 5’3’. Spiazza lo strand omologo del duplex.
Esso permette la Nick translation, specifica di Pol I.
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