EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICSExtracció: treure els components des d'un compartiment cel lular. Involucra: trencament de les cèl lules que contenen als AN Inactivació de nucleases Clarificació: separació dels AN de les restes cel lulars (debris). Purificació: Separació d'AN: de proteïnes solubles D'altres AN no desitjats De lípids, carbohidrats De sals i altres compostos orgànics
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS I PROTEÏNES
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
Extracció: treure els components des d'un compartiment cel lular. Involucra: trencament de les cèl lules que contenen als AN Inactivació de nucleases Clarificació: separació dels AN de les restes cel lulars (debris). Purificació: Separació d'AN: de proteïnes solubles D'altres AN no desitjats De lípids, carbohidrats De sals i altres compostos orgànics
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
Per a moltes aplicacions que involucren manipulació d'AN és necessari disposar d'aquests en estat pur. Per què purificar? Nucleases que s'alliberen al lisar les cèl lules degraden els àcids nucleics. Interferents que inhibeixen als enzims que s'usen en enginyeria genètica. El desafiament és separar els àcids nucleics desitjats des d'una barreja complexa, mantenint la integritat dels AN Contaminants: Proteïnes, lípids i carbohidrats, sals del medi, ions, etc.
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
ETAPES BÀSIQUES D’UN PROCEDIMENT D’EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ D’AN Disgregació o fragmentació del teixit Trencament cel·lular Clarificació Purificació Anàlisi Amb inactivació de nucleases Condicions de treball estèrils i guants Quantitatiu : espectrofotometria UV Qalitatiu: electroforesi
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
Mètodes de fragmentació cel·lular per l’ extracció d’AN Métodes químics Detergents Sals Métodes enzimátics Lysozima: trenca enllaços -1.4- entre N-acetil murámic y N-acetil glucosamina de peptidoglicà de la paret cel·lular de bacteris Lyticasa: trenca enllaços -1.3 de glucano de llevats Proteasas: trenca enllaços peptídics de proteïnes de paret i membrana plasmàtica e interaccions cèl·lula-cèl·lula. Mètodes físics Congelació/descongelació Homogeneïtzació Mòlta manual en morter Boletes de vidre sonicació
Altres components d’una solució per trencar cèl·lules: EDTA: inhibeix l’acció de nucleases Amortiguador de pH(7-8) CLARIFICACIÓ : ELIMINACIÓ DE RESTES CEL·LULARS Centrifugació Filtració Enzims + centrifugació
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
PURIFICACIÓ Fenol : precipita proteïnes Precipitació de proteïnes amb sals Precipitació de l’ADN amb alcohol (o sal) Cromatografia Electroforesi en gels d’agarosa Kits comercials
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
CROMATOGRAFIA D’INTERCANVI ANIÒNIC
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
DNA eluye de la sílica en agua DNA se une a la sílica en NaI CROMATOGRAFIA D’ADSORCIÓ AMB SÍLICE
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
Anàlisi espectrofotomètric d’ AN i criteris de puresa Abs230/Abs260 ha de ser menor de 0.5 (> indica contaminació amb fenol, CHCl3 (cloroform) o carbohidrats). Abs260/Abs280 ha de ser ~1.8 (< indica contaminació amb proteïnes ) Abs320 hauria de ser baixa.
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
Extracció de DNA plasmidial de bacteris: Mètode de Lisis alcalina Centrifugació del cultiu Resuspensió en solució amortidora de pH + EDTA. Lisis y desnaturalització alcalina SDS, un detergent que dissol lípids de membrana. Desnaturant de proteínas. NaOH (pH >12): Afebleix la paret cel·lular y allibera el contingut de la cèl·lula. Ajuda en la desnaturalització de proteïnes. Desnatura el DNA. Els dos fils de DNA (cromosomal y plasmidial) se separen.
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
Neutralització amb acetat d’amoni : s’afavoreix el procès de precipitació de l’ADN genòmic, mentres que l’ADN plasmídic ha renaturalitzat més ràpid i es manté en solució. Extracció i purificación del DNA genòmic de bacteris Sedimentació de les cèl·lules d'un cultiu . Resuspensió dels bacteris en buffer i incubació en detergent (SDS), proteinasa K. Extracció amb fenol. Precipitació dels àcids nucleics amb EtOH/NaCl. Sedimentació del DNA per centrifugació. Tractament amb Ribonucleasa A. Precipitació del DNA amb isopropanol. Resuspensió del DNA en buffer amb EDTA.
EXTRACCIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS
Extracció i purificació de RNA Lisi en presència d'agents desnaturants forts de proteïnes iADN(tiocianat de guanidina,fenol àcid) i inactivació de ARNasas.(amb cloroform, DEPC, SDS) Extracció amb fenol àcid (pH 4.5) Precipitació amb etanol S'obté mescla de mRNA, rRNA i tRNA Purificació de mRNA mitjançant cromatografia d'afinitat a polidT (DNA sintètic,compost per 15 nucleòtids amb base timina)
EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE PROTEÏNES
Mètodes de ruptura cel·lular i extracció de proteïnes Lisi cel·lular Destrucció mecànica Congelació-descongelació
EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE PROTEÏNES
Quantificació de proteïnes Mètode de Lowry: Les proteïnes reaccionen amb el reactiu de Folin-Ciocalteau per donar un complex acolorit. La intensitat del color depén del contingut de proteïna. catalitzador
EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE PROTEÏNES
Mètode del Biuret Les proteïnes formen complexos de color púrpura amb sals de coure en solució alcalina. La intensitat del color depén del contingut de proteïna.
EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE PROTEÏNES
Mètode de Bradford El mètode està basat en la interacció entre el colorant blau de Comassie (Reactiu de Bradford) amb les proteïnes. Aquest colorant quan interacciona amb les proteïnes absorbeix a 595 nm donant una coloració blau. La mesura de la seva absorció ens permetrà determinar la concentració de la proteïna en la nostra mostra. Mètode espectrofotomètric Es basa en la propietat de les proteïnes de tenir un màxim d'absorció a 280 nm a causa del contingut en els aminoàcids tirosina i triptòfan. La variabilitat en aquests aminoàcids en diferents proteïnes obliga a afegir un factor de correcció aportat per l'absorbància de l'enllaç peptídic a 205 nm. La concentració es pot obtenir aplicant la següent expressió:
EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE PROTEÏNES
MÈTODES CROMATOGRÀFICS PER LA SEPARACIÓ DE PROTEÏNES Cromatografia d'exclusió o filtració en gel Els gels normalment utilitzats són de tres tipus: dextrà (sephadex), agarosa i poliacrilamida.
Comments