Dört reaksiyon setinden elde edilen parçacıklara elektroforez uygulanarak jelde yan yana yürümeleri sağlanır.
DNA DİZİLEME YÖNTEMLERİ
DNA DİZİ ANALİZİ KULLANILAN YÖNTEMLER MAXAM-GİLBERT SANGER&COULSON PYROSEQENCING NANO SEQUENCING MANUEL DİZİ ANALİZİ OTOMATİK DİZİ ANALİZİ
MAXAM-GİLBERT YÖNTEMİ (kimyasal kırılma yöntemi) Bu yöntemin prensibi hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asitin, DNA’ da bulunan bazları özgül olarak değiştirmesine ve daha sonra eklenen piperidinin değişikliğe uğramış nükleotidlerin bulunduğu noktalardan zinciri kırmasına dayanır.
Bu yöntemde;
1.Nükleotid dizisi saptanacak olan DNA önce 5’- ucundan 32P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir.
2.DNA’ nın iki iplikçiği birbirinden ayrılarak ya da DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilerek DNA’ nın yalnızca bir ucundan işaretlenmesi sağlanır.
3.DNA molekülleri dört tüpe ayrılarak A, C, G ya da T nükleotidlerini değiştirmek ve kırmak için gerekli tepkimeler gerçekleştirilir.
4.Reaksiyon için kısıtlı bir süre verilerek her tüpde farklı pozisyonlardaki hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilir.
5.Sonuçta kırılmanın olduğu pozisyona göre hepsi 5’- pozisyonlarından işaretli ancak boyları birbirinden farklı bir dizi DNA fragmenti elde edilmiş olur.
6.Elde edilen boyları gittikçe kısalan DNA dizileri, jel elektroforezi ile birbirlerinden büyüklüklerine göre ayrılır ve otoradyografi uygulanarak bantlar görüntülenir. Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıklarının en kısası en önde olmak üzere yol alırlar. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde saptanan parçacıklar kırılma pozisyonlarına göre okunurlar.
MAXAM-GILBERT YÖNTEMİNDE KULLANILAN KİMYASALLAR Özgül baz Baza özgül kimyasal Baz ayırmada kullanılan kimyasal Zincir kırmada kull. kimyasallar G Dimetil sülfat Piperidin Piperidin A+G Asit Asit Piperidin C+T Hidrazin Piperidin Piperidin C Hidrazin+baz Piperidin Piperidin A>C Baz Piperidin Piperidin
Pürinlerin kırılmasında dimetil sülfat kullanılır.
Dimetil sülfat ile metillenen DNA’ya
Piperidin uygulanırsa Piperidin uygulanırsa
DNA guanin bazından kırılır DNA adenin bazından kırılır
Pirimidin bazlarının kırılması ise hidrazin ile yapılır.
Hidrazin DNA’yı hem sitozin hem de timin bazından kırar. Bu iki reaksiyonu ayırmak için yüksek tuz konsantrasyonu (2 M NaCl) ve bazik ortam kullanılır. Yüksek tuz derişimi ile bazik ortamda DNA sitozin bazından kırılır. bazik ortam asidik ortam
SANGER-COULSON YÖNTEMİ (zincir sonlandırma yöntemi) Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır. Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.
DNA sentezini sağlamak için;
Klenov,Taq DNA polimeraz, ters transkriptaz ya da sekuenaz enzimlerinden birisi kullanılabilir.
Yöntemin temeli DNA polimerazın dNTP’lerin (deoksiribonükleozit trifosfat) yanı sıra deoksiribozun 3’ pozisyonunda OH grubu taşımayan ddNTP’ leri de (dideoksiribonükleozit trifosfat) substrat olarak kullanabilmesine dayanır.
Sentezlenen DNA’ ya bir ddNTP’ nin katılması 3’ pozisyonunda OH grubu olmadığı için sentezi durdurur.
Dizi analizi yapılırken dört ayrı reaksiyon karışımı hazırlanır. Her bir karışım kalıp DNA zinciri, bir primer, dNTP’ lerin dördü ve az miktarda ddNTP’lerden birini içerir. Özgül zincir sonlanması için her bir reaksiyonda farklı bir ddNTP bulunur.
Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleotid kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmenti meydana gelir.
Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülür. Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde, tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan ddNTP’ nin tipine göre okunur.
Sanger-Coulson Yönteminde Kullanılan Kimyasallar
-Primerler -Kalıp DNA
-Enzimler -Elektroforez
PRİMERLER ÖNEMİ:
İstenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır. Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’nın genomik DNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında ve yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3’ ucu sağlar.
Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir. Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizi analizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip, dizi analizi reaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasında ve dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır. Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır ve böylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur.
KALIP DNA Hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır. PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun hassasiyetini bozacaktır.
ENZİMLER
Bir çok tipde DNA polimeraz enzimi kullanılabilmektedir. Bu enzimlerin ortak özellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.
Kullanılan enzimlere örnekler 1.E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I
İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyük dezavantajı vardır. Birincisi enzimin kontrolsüz olarak çoğaltma reaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzun okumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir. İkincisi enzimin homopolimerik bölgelerde istenilen verimde çalışmamasıdır.
2.Ters Transkriptaz
Ters transkriptaz enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkin çözüm verir. Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır.
Sekuenaz Enzimleri
T7 bakteriofajın’dan elde edilirler. Enzimin 3’-5’ ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir.Bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır. Kalıp DNA’ nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir.
Taq DNA Polimeraz
Özelilikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan bir enzimdir.Özellikle 95 0C’ de aktif olması nedeni ile homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir.
ELEKTROFOREZ DNA molekülleri fosfat grubu taşıdıkları için eksi yüklüdür ve anoda doğru hareket eder. Bu hareket DNA’ nın yapısına ve uzunluğuna bağlıdır.
Jel boyunca kısa DNA fragmentleri daha hızlı yol alırken uzunluk arttıkça DNA’ nın hızı azalır. Elde edilen farklı uzunluklardaki fragmentlerin birbirlerinden ayrılması ve tanımlanmasında DNA’nın bu özelliği kullanılır.
Birbirinden farklı sonlanmalara sahip reaksiyon ürünleri dört ayrı kulvarda söz konusu jel matrikse yüklenir.
DNA fragmentleri oluşturulacak elektriksel alanda uzunluklarına göre sıralanırlar ve DNA dizisi jelden okunur.
Poliakrilamid jeller yüksek ayırım gücüne sahiptir, uygun süre ve uygun voltajda tek bir nükleotid farkını bile ayırabilir.
DNA dizi analizi reaksiyonu sonucu elde edilen fragmentler jel üzerinde gümüş boyama, radyoaktif veya floresan boyalarla işaretlenerek tespit edilebilir.
Otomatik DNA cihazlarının gelişmesi ile poliakrilamid jellerin yerini polikarbon bileşikleri olan polimerler almıştır. Bu polimerler yoğunluklarına göre farklı ayrım gücüne sahiptirler.
A) Manuel DNA Dizi Analizi
Sekans reaksiyonu kullanılarak zincir sonlandırma metodu uygulanır. Örnekler%6’lık denatüre edici poliakrilamid jelde ayrıştırılarak, otoradyografille görüntülenir. Çalışılan gen amplifiye edildikten sonra enzimatik ön muamele yapılır. Bu amaçla hidrolitik enzimler (alkalin fosfataz ve ekzonükleaz I ) kullanılır. Ekzonükleaz I ortamdaki tek zincirli DNA iplikciklerini, alkalin fosfataz ise dNTP’leri uzaklaştırarak, dizi reaksiyonu için kullanılacak amplifikasyon ürününün temizlenmesini sağlar. İşlem tamamlandıktan sonra enzimleri inaktive etmek için, örnek karışımı800C’da 15' bekletilir.
Primer Tutunma Reaksiyonu
Temizlenmiş amplifikasyon ürünü üzerine primer ilave edilir. Karışım100 0C’da inkübe edildikten sonra, önce buzlu su içinde, sonra buzda bekletilir. Örneğin bu şekilde kademeli olarak soğutulması, kalıp katlanmasını ve primerlerin kendi aralarında eşleşmesini önler.
İşaretleme Reaksiyonu
İşaretleme reaksiyonu için dört farklı tüp hazırlanır. Her bir tüp dört çeşit dNTP’nin yanı sıra bir ddNTP içerir. Bu aşamada kullanılan DNA polimeraz T7 bakteriofaj DNA polimerazının modifiye formudur. Bu enzim 3‘5' ekzonükleaz aktivitesi içermez. Enzimin polimerizasyon hızı çok yüksek olup, DNA zincirine ddNTP takabilme özelliğine de sahiptir. Reaksiyon karışımı 5' oda sıcaklığında bekletilir.İşaretleme aşamasında kullanılan işaretleme çözeltisi üç farklı dNTP içerir. Dördüncü tip dNTP, karışıma ilave edilen radyoaktif işaretli dNTP’dir.
Sonlandırma Reaksiyonu
Zincir sonlanması 3'OH grubu bulunmayan nükleotid analoglarının (ddNTP) zincire takılması ile sağlanır. Dört farklı sonlandırma çözeltisinin her biri 80μl eşit dNTP(A; C; G; T) ve 8μl tek bir bazın ddNTP’sini içerir. Sonlandırma için hazırlanan tüplerin her birine sonlandırma çözeltisi reaksiyon karışımından ilave edilir. Tüplere formamid içeren durdurma çözeltisi eklenerek reaksiyon durdurulur. Bu örnekler jele yüklemeden önce denatüre edilir.
Reaksiyon Ürünlerinin Elektroforezi
Örneklerin görüntülenmesi için ürünler denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutulurlar. Jel hazırlandıktan ve polimerizasyon işlemi tamamlandıktan sonra ortamda kalan üre temizlenir. Elektroforez tamponu olarak 1X TBE kullanılır. Sisteme70 watt, 1800 volt ve 50mA elektrik akımıverilerek15-30’ ön elektroforez uygulanır. Bu uygulama tamlandıktan sonra yapılan DNA Dizi Analizi reaksiyonları jele yüklenerek 2.5-3 saat yürütme yapılır.
Comments